Upotreba i mjere opreza epruvete za ultrafiltracionu centrifugu
1) Odaberite odgovarajuću ultrafiltracijsku cijev.Imajte na umu da se UF membrane razlikuju po nivou tolerancije na različite hemikalije.Tipično, epruvete za ultrafiltraciju sa graničnom molekulskom težinom od 10 kDa mogu se odabrati sa graničnom molekulskom težinom koja ne bi trebala biti veća od 1/3 molekulske težine proteina od interesa, kao što je 35 kDa.Ako je molekularna težina proteina od interesa oko 10 kd, može se koristiti ultrafiltracijska cijev s graničnom molekulskom težinom od 3 kd.
(2) Ultrafiltracija, svježe kupljena, je suha, sa ultračistom vodom dodanom prije upotrebe i vodom koja je potpuno prošla kroz membranu, ledenu kupku ili hladnjak prethodno ohlađenu nekoliko minuta.Zatim se odlije voda, tj. proteinska tekućina, i koliko se doda, što nije više od bijele linije na vrhu epruvete.Operacija je lagana, a epruvetu za ultrafiltraciju potrebno je prethodno ohladiti na ledu prije dodavanja proteinske otopine.
3) I masa i centar gravitacije su trebali dostići ravnotežu.Imajte na umu da brzina rotacije i ubrzanje nisu vrlo brzi, inače direktno oštećuju ultrafiltracijsku membranu.Započeta je centrifugalna ultrafiltracija (centrifuga prethodno ohlađena na 4 stepena).Nakon što je broj obrtaja različitih centrifuga pretvoren u g, bio je drugačiji.Ubrzanje centrifuge je podešeno na minimum, smanjujući pritisak na membranu.Napomena, obavezno napustite centrifugu nakon što centrifuga dostigne svoju odredišnu brzinu, ili ako imate problem, ne možete se nositi s njim prvi put.Orijentacija membrane prema vretenu je podešena prema uputstvu (kutna kutija centrifuge je membrana na os okomita).U praktičnoj upotrebi, opšta brzina rotacije je niža od one u uputstvu, tako da se životni vek cevi za centrifugu može produžiti.
3) I masa i centar gravitacije su trebali dostići ravnotežu.Imajte na umu da brzina rotacije i ubrzanje nisu vrlo brzi, inače direktno oštećuju ultrafiltracijsku membranu.Započeta je centrifugalna ultrafiltracija (centrifuga prethodno ohlađena na 4 stepena).Nakon što je broj obrtaja različitih centrifuga pretvoren u g, bio je drugačiji.Ubrzanje centrifuge je podešeno na minimum, smanjujući pritisak na membranu.Napomena, obavezno napustite centrifugu nakon što centrifuga dostigne svoju odredišnu brzinu, ili ako imate problem, ne možete se nositi s njim prvi put.Orijentacija membrane prema vretenu je podešena prema uputstvu (kutna kutija centrifuge je membrana na os okomita).U praktičnoj upotrebi, opšta brzina rotacije je manja od one u uputstvu, tako da se životni vek cevi za centrifugu može produžiti.
(4) Kada se koncentriše do preostalih 1ml, uzmite 50ul puferske otopine, dodajte 10ul protoka i vidite ima li plave boje, kao procjenu da li ultrafiltracionoj cijevi nedostaje protein.Ako epruveta curi, ponovo sipajte gornji sloj i proticajte u novu epruvetu da biste započeli ultrafiltraciju.Da biste precizno utvrdili da li su epruvete propuštene, centrifugirajte 10 minuta sa 5 mgml BSA prije protoka, radeći na proteinskom ljepilu ili Bradfordovom sirovom testu, i nastavite dodavanjem preostalog koncentriranog proteinskog rastvora (koji djeluje na led i sprječava zagrijavanje proteina) sve dok sav koncentrat je dodat.Budite oprezni tokom centrifugiranja ako dođe do precipitacije proteina, što dovodi do zatvaranja epruvete.Ako dođe do precipitacije, utvrdite da li je specifični uzrok precipitacije prekomjerna koncentracija proteina ili neodgovarajući pufer;Prvi se može riješiti ultrafiltracijom više ultrafiltracijskih cijevi istovremeno, smanjujući koncentraciju, a drugi razmjenom različitih puferskih otopina dok ne dođe do precipitacije proteina.
(4) Kada se koncentriše do preostalih 1ml, uzmite 50ul puferske otopine, dodajte 10ul protoka i vidite ima li plave boje, kao procjenu da li ultrafiltracionoj cijevi nedostaje protein.Ako cijev curi, ponovo sipajte gornji sloj i proticajte u novu cijev da biste započeli ultrafiltraciju.Da biste precizno utvrdili da li su epruvete propuštene, centrifugirajte 10 minuta sa 5 mgml BSA prije protoka, radeći na proteinskom ljepilu ili Bradfordovom sirovom testu, i nastavite dodavanjem preostalog koncentriranog proteinskog rastvora (koji djeluje na led i sprječava zagrijavanje proteina) sve dok sav koncentrat je dodat.Vodite računa tokom centrifugiranja ako dođe do taloženja proteina, što dovodi do zatvaranja epruvete.Ako dođe do precipitacije, utvrdite da li je specifični uzrok taloženja prekomjerna koncentracija proteina ili neodgovarajući pufer;Prvi se može riješiti ultrafiltracijom više ultrafiltracijskih cijevi istovremeno, smanjujući koncentraciju, a drugi razmjenom različitih puferskih otopina dok ne dođe do precipitacije proteina.
(5) Prvih nekoliko koraka koristi se za koncentriranje proteina, a ako se pufer mijenja, lagano dodajte novi pufer (ultrafiltracija kroz ultrafiltracijsku membranu od 0,22um) na oko 1ml ukupnog proteina i ponovo koncentrirajte na oko 1ml tri uzastopnih puta, s konačnim koncentrisanim konačnim volumenom koji ovisi o željenoj koncentraciji proteina, općenito ne više od 500ul, ali i unutar 200ul.Ostvarite 1000 × ili više u tri navrata, u suštini onoliko promjene pufera, koliko se izračunava obogaćivanjem volumena od najmanje 10 × svaki put.
(5) Prvih nekoliko koraka koristi se za koncentriranje proteina, a ako se pufer mijenja, lagano dodajte novi pufer (ultrafiltracija kroz ultrafiltracijsku membranu od 0,22um) na oko 1ml ukupnog proteina i ponovo koncentrirajte na oko 1ml tri uzastopnih puta, s konačnim koncentrisanim konačnim volumenom koji ovisi o željenoj koncentraciji proteina, općenito ne više od 500ul, ali i unutar 200ul.Ostvarite 1000 × ili više u tri navrata, u suštini onoliko promjene pufera, koliko se izračunava obogaćivanjem volumena od najmanje 10 × svaki put.
Vrijeme objave: Nov-09-2022