PCR, je lančana reakcija polimeraze, koja se odnosi na dodavanje dNTP, Mg2+, faktora elongacije i faktora pojačanja amplifikacije sistemu pod katalizom DNK polimeraze, koristeći matičnu DNK kao šablon i specifične prajmere kao početnu tačku ekstenzije, Kroz korake denaturacije, žarenja, ekstenzije, itd., proces in vitro replikacije DNK kćeri lanca komplementarne matičnoj lancu DNK šablona može brzo i specifično pojačati bilo koju ciljnu DNK in vitro.
1. Hot Start PCR
Vreme početka amplifikacije u konvencionalnom PCR-u nije da se PCR mašina stavi u PCR mašinu, a zatim program počinje da se umnožava.Kada je konfiguracija sistema završena, počinje amplifikacija, što može uzrokovati nespecifično pojačanje, a vrući start PCR može riješiti ovaj problem.
Šta je to hot start PCR?Nakon što je reakcioni sistem pripremljen, enzimski modifikator se oslobađa na visokoj temperaturi (obično višoj od 90°C) tokom početne faze zagrevanja reakcije ili faze „hot start“, tako da se aktivira DNK polimeraza.Tačno vrijeme aktivacije i temperatura zavise od prirode DNK polimeraze i modifikatora vrućeg starta.Ova metoda uglavnom koristi modifikatore kao što su antitijela, ligandi afiniteta ili kemijski modifikatori za inhibiciju aktivnosti DNK polimeraze.Pošto je aktivnost DNK polimeraze inhibirana na sobnoj temperaturi, tehnologija vrućeg starta pruža veliku pogodnost za pripremu višestrukih PCR reakcijskih sistema na sobnoj temperaturi bez žrtvovanja specifičnosti PCR reakcija.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverzna transkripcija PCR) je eksperimentalna tehnika za reverznu transkripciju iz mRNA u cDNK i korištenje kao šablona za amplifikaciju.Eksperimentalni postupak je da se prvo ekstrahuje ukupna RNK u tkivima ili ćelijama, koristi Oligo (dT) kao prajmer, koristi reverzna transkriptaza za sintetizaciju cDNK, a zatim se koristi cDNK kao šablon za PCR amplifikaciju da bi se dobio ciljni gen ili detektovala ekspresija gena.
3. Fluorescentni kvantitativni PCR
Fluorescentni kvantitativni PCR (Kvantitativni PCR u realnom vremenu,RT-qPCR) se odnosi na metodu dodavanja fluorescentnih grupa u PCR reakcijski sistem, koristeći akumulaciju fluorescentnih signala za praćenje cjelokupnog procesa PCR-a u realnom vremenu, i konačno korištenje standardne krive za kvantitativnu analizu šablona.Najčešće korištene qPCR metode uključuju SYBR Green I i TaqMan.
4. Ugniježđeni PCR
Nested PCR se odnosi na upotrebu dva seta PCR prajmera za dva kruga PCR amplifikacije, a proizvod amplifikacije drugog kruga je fragment ciljnog gena.
Ako neusklađenost prvog para prajmera (spoljnih prajmera) uzrokuje amplifikaciju nespecifičnog proizvoda, mogućnost da drugi par prajmera prepozna istu nespecifičnu regiju i da nastavi da se amplifikuje je vrlo mala, pa je amplifikacijom drugim parom prajmera, poboljšana je specifičnost PCR-a.Jedna od prednosti izvođenja dva kruga PCR-a je da pomaže u amplifikaciji dovoljnog proizvoda iz ograničene početne DNK.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR je metoda za poboljšanje specifičnosti PCR reakcije podešavanjem parametara PCR ciklusa.
U touchdown PCR-u, temperatura žarenja za prvih nekoliko ciklusa je postavljena nekoliko stepeni iznad maksimalne temperature žarenja (Tm) prajmera.Viša temperatura žarenja može efikasno smanjiti nespecifičnu amplfikaciju, ali u isto vrijeme, viša temperatura žarenja će pogoršati razdvajanje prajmera i ciljnih sekvenci, što rezultira smanjenim prinosom PCR-a.Stoga, u prvih nekoliko ciklusa, temperatura žarenja se obično postavlja na smanjenje za 1°C po ciklusu kako bi se povećao sadržaj ciljnog gena u sistemu.Kada se temperatura žarenja spusti na optimalnu temperaturu, temperatura žarenja se održava za preostale cikluse.
6. Direktni PCR
Direktni PCR se odnosi na amplifikaciju ciljne DNK direktno iz uzorka bez potrebe za izolacijom i pročišćavanjem nukleinske kiseline.
Postoje dvije vrste direktnog PCR-a:
direktna metoda: uzmite malu količinu uzorka i dodajte je direktno u PCR Master Mix za PCR identifikaciju;
metoda krekiranja: nakon uzorkovanja uzorka, dodajte ga u lizat, lizirajte da biste oslobodili genom, uzmite malu količinu liziranog supernatanta i dodajte ga u PCR Master Mix, izvršite PCR identifikaciju.Ovaj pristup pojednostavljuje eksperimentalni radni tok, smanjuje vrijeme rada i izbjegava gubitak DNK tokom koraka pročišćavanja.
7. SOE PCR
Spajanje gena preklapajućim proširenjem PCR (SOE PCR) koristi prajmere sa komplementarnim krajevima kako bi PCR proizvodi formirali preklapajuće lance, tako da u naknadnoj reakciji amplifikacije, kroz produžetak preklapajućih lanaca, različiti izvori A tehnike u kojoj se amplificirani fragmenti preklapaju i spojeni zajedno.Ova tehnologija trenutno ima dva glavna pravca primene: konstrukcija fuzionih gena;genska mutacija usmjerena na mjesto.
8. IPCR
Inverzni PCR (IPCR) koristi reverzne komplementarne prajmere za amplifikaciju DNK fragmenata koji nisu dva prajmera, i amplificira nepoznate sekvence na obje strane poznatog fragmenta DNK.
IPCR je prvobitno dizajniran da odredi sekvencu susednih nepoznatih regiona, i uglavnom se koristi za proučavanje sekvenci promotora gena;onkogenih kromosomskih preuređivanja, kao što su fuzija gena, translokacija i transpozicija;i integracija virusnih gena, takođe se sada često koriste. Za mutagenezu usmjerenu na mjesto, kopirajte plazmid sa željenom mutacijom.
9. dPCR
Digitalni PCR (dPCR) je tehnika za apsolutnu kvantifikaciju molekula nukleinske kiseline.
Trenutno postoje tri metode za kvantifikaciju molekula nukleinske kiseline.Fotometrija se zasniva na apsorpciji molekula nukleinske kiseline;fluorescentni kvantitativni PCR u realnom vremenu (PCR u realnom vremenu) zasniva se na vrijednosti Ct, a vrijednost Ct se odnosi na broj ciklusa koji odgovara vrijednosti fluorescencije koja se može detektovati;digitalni PCR je najnovija kvantitativna tehnologija zasnovana na jednomolekulskoj PCR metodi za brojanje nukleinskih kiselina. Kvantitifikacija je apsolutna kvantitativna metoda.
Vrijeme objave: Jun-13-2023